La surexpression de l'androgen-binding protein (ABP) provoque des modifications morphologiques et fonctionnelles dans le testicule de souris

Resume

Les cellules de Sertoli (CS) de nombreuses espèces produisent une androgen-binding protein (ABP) secrétée à la fois vers le compartiment sanguin et vers la lumière des tubes séminifères. Depuis cette dernière, elle est transportée jusqu'à l'épididyme où elle est captée par les cellules épithéliales. De nombreux arguments sont en faveur d'un rôle de l'ABP dans la maturation des spermatozoïdes. Au regard de l'importance possible de l'ABP il nous a semblé judicieux de créer des lignées de souris transgéniques (ST) portant le gène de l'ABP de rat (ABPr) afin de déterminer son rôle dans la physiologie de la reproduction chez le mâle.

Un clone d'ADN génomique de rat de 5.5 Kb a été injecté dans le pronucleus d'ovocytes fécondés de souris. Ces ovocytes ont été réimplantés dans l'utérus de receveuses pseudo-gestantes CD-1. La détection des ST a été effectuée par Southern Blot et par PCR à l'aide respectivement d'un ADNc d'ABPr marqué par 32P et par des oligo-nucléotides reconnaissant les exons 1 et 7 du gène de l'ABPr. La localisation chromosomique des transgènes a été effectuée par hybridation in-situ de fluorescence (FISH) dans des cellules de moelle osseuse en métaphase de ST/ABPr. L'expression a été analysée par Northen Blot et RT-PCR dans la plupart des tissus des ST hétérozygotes. Dans le testicule, l'expression cellulaire du transgène a été determinée par hybridation in-situ (HIS) et la localisation de la protéine a été révélée par immunocytochimie. L'activité de liaison de l'ABP a été effectuée par la méthode au carbone dextran et l'étude de l'internalisation de la protéine a reposé sur la détection par autohistoradiographie à haute résolution du complexe ABP (3H) Testosterone. La fragmentation de l'ADN a été étudiée par la technique TUNEL et par électrophorèse de I'ADN génomique total. La morphologie du testicule et de l'épididyme a éte étudiée en microscopie optique et électronique.

Deux nouveau-nés portant le gène de l'ABPr ont eté identifiés par Southern Blot et deux lignées de souris (lignée ABP 7 et ABP 24) ont été obtenues par croisement de ces souris mâles fondatrices avec des souris femelles B6D2FI. L'analyse par FISH a permis de mettre en évidence une localisation chromosomique différente du transgène dans les 2 lignées. Les descendants de ces 2 lignées présentent tous une hypofertilité. Les résultats des Northern Blot et l'RT-PCR montrent une surexpression de ARNm de l'ABPr dans le testicule, l'ovaire et l'utérus des lignées transgéniques ABP 24 et ABP 7. L'expression de l'ARNm du gène de l'ABPr est spécifiquement retrouvée dans les CS par HIS. La liaison de (3H) DHT avec des homogénats testiculaires est augmentée d'un facteur 10 par rapport aux témoins. Dans les testicules des ST adultes certains tubes séminifères montrent une désorganisation de l'épithélium, une augmentation du nombre des CS, la présence de cavitations, un arrêt de la progression méiotique et une dégénérescence des cellules germinales. Nous avons constaté également une fragmentation du DNA dans les cellules germinales en méiose. La protéine elle-même (ABPr) est présente dans l'espace interstitiel et, au niveau de certains tubules, dans les CS et dans les cellules germinales à différents stades de maturation. L'internalisation de l'ABPr est augmentée à la fois dans les cellules germinales et dans les cellules de l'epithélium épididymaire.

L'ensemble de ces résultats renforce l'hypothèse du rôle de l'ABP au cours de la spermatogénèse même si des expériences complémentaires sont nécessaires pour prouver définitivement son implication dans le contrôle de l'homéostasie testiculaire et épididymaire.

Abstract

The Sertoti cells (SC) of many species produce an androgen-binding protein (ABP) which is secreted into both the blood and lumen of the seminiferous tubule. In the latter, it is transported to the epididymis where is taken up by epithelial cells, and is thought to play a role in sperm maturation. In view of the importance of ABP, we thought it would be pertinent to make several transgenic mice (TM) lines bearing the rABP gene to unravel its role in male reproductive physiology.

A 5.5 Kb rat genomic DNA clone was microinjected into the pronucleus of fertilized mouse ova which were subsequently implanted into the oviduct of pseudopregnant CD-1 female mice. Detection of TM was performed by Southern Blot and PCR analysis using respectively, a 32p labeled rABP cDNA probe and oligonucleotides recognizing exons 1 and 7 of rABP gene. Chromosomic localization of the transgene was carried out by fluorescent in situ hybridization (FISH) in metaphasic cells obtained from bone marrow of TM. rABP expression was analyzed by Northern blot and RT-PCR techniques in most tissues of heterozigote TM. In the testis, specific cell expression was determined by in situ hybridization (ISH) and protein localization by immunohistochemistry. ABP-binding activity was performed by the carbon dextran method and analysis of protein internalization by autohistoradiographic detection of a (3H) testosterone-ABP complex. DNA fragmentation was investigated by the TUNEL technique and by electrophoresis of total genomic DNA. Testicular and epididymal morphology was studied by light and electron microscopy.

Two offspring carrying the rABP gene were identified by Southern blotting, and two lines of mice (designated ABP7 and ABP24) were generated by selective breeding of the male founders with normal B6D2F1 females. FISH analysis demonstrated a different chromosomal localization of the transgene in both lines. Both rABP transgenic pedigrees presented reduced fertility. Northern blot and RT-PCR studies showed overexpression of rABP mRNA in the testis. ovary and uterus in ABP24 and ABP7 transgenic lines. rABP mRNA was appropriately expressed in SC as demonstrated by ISH. DHT-sH binding of testicular homogenates was increased 10 fold in TM compared to controls. In adult testis of TM, some seminiferous tubules showed disorganization of the epithelium, increased number of SC, presence of vacuoles, germ cell meiotic arrest and germ cell degeneration. DNA fragmentation was demonstrated in germ cells during meiosis. rABP protein was localized in the intersticial space, and into some tubules, in SC and germ cells at different steps of maturation. rABP internalization was strongly increased in both germ and epididymal cells in TM. The present results reinforce the increasing evidence of the role of ABP during spermatogenesis, even though further experiments are required to unravel its definitive implication in testicular and epidididymal homeostasis.