Localisation du récepteur des androgènes dans le testicule

Resume

La question de savoir si les cellules de la lignée germinale possèdent ou non des récepteurs aux androgènes reste débattue. Dans ce travail nous avons déterminé la distribution des récepteurs aux androgènes dans le testicule de rat et de souris à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin purifié par affinité, dirigé contre un peptide de 21 acides aminés de la région terminale du récepteur des androgènes (RA), marqué par le système biotine-streptavidine immunoperoxidase.

La spécificité de l'anticorps est attestée par les points suivants: 1) Présence d'une bande spécifique approximativement à 110 kD en Western immunoblot; 2) Elimination spécifique du marquage par pré-adsorption de l'anticorps avec le peptide de 21 acides aminés; 3) Mise en évidence d'une relation entre l'intensité du marquage dans toutes les cellules RA positives en fonction de la dilution des antisérums; 4) Mise en évidence dans tous les tissus connus pour exprimer de façon importante des RA (par exemple l'épididyme, la prostate, les vésicules séminales) d'un marquage extrêmement intense au niveau du noyau des cellules épithéliales; 5) Obtention d'un réaction RA positive avec les anticorps dans les lignées de cellules prostatiques connues pour exprimer les récepteurs aux androgènes; 6) Positivation de cellules COS-7 après leur transfection par un vecteur exprimant le récepteur aux androgènes de rat. De plus la distribution intracellulaire des RA dans les cellules COS-7 est fonction de la présence d'androgènes dans le milieu.

L'immunolocalisation des récepteurs aux androgènes montre les points suivants: à l'intérieur du compartiment interstitiel chez le rat adulte des RA sont détectés dans quelques cellules de Leydig et dans toutes les cellules musculaires lisses formant la paroi des vaisseaux sanguins, alors que les cellules endothéliales restent négatives. Dans les tubes séminifères les RA sont observés dans tous les noyaux des cellules myoïdes péritubulaires, mais pas dans les couches plus périphériques correspondant aux cellules endothéliales des vaisseaux lymphatiques. Dans les cellules de Sertoli le marquage nucléaire des RA est spécifique du stade de l'épithélium séminifère: la positivité du marquage commence à devenir évidente vers le stade IV tardif du cycle, atteint un pic très fort aux stades VII et VIII puis disparaît complètement. Un immunomarquage spécifique a également été mis en évidence dans les noyaux des spermatides allongées stade XI, stade auquel l'élongation nucléaire est déjà apparente mais sans que la condensation de la chromatine soit déjà commencée. Dès le début de la condensation de la chromatine des spermatides allongées, l'immunomarquage nucléaire disparaît en même temps que le cytoplasme devient positif. Globalement les mêmes observations ont été faites sur le testicule de Souris adulte, excepté le fait que, dans cette espèce, toutes les cellules de Leydig sont très fortement RA positives.

Afin de confirmer l'immunomarquage des RA nous avons réalisé des études d'hybridation in situ dans le testicule de Rat adulte à l'aide d'une sonde antisens ARNc de 236 paires de bases (I'ADNc de RA nous a été donné par le Docteur Chang, Université du Wisconsin, Madison, WI). Un important signal d'hybridation a été observé à la base de l'épithélium séminifère, dans la région occupée par les cellules de Sertoli et les spermatogonies. Ceci nous a conduit a réexaminer les résultats de l'immunomarquage afin de déterminer si les spermatogonies étaient également positives pour les anticorps anti RA. Nos résultats préliminaires sont en faveur de la présence de RA dans certaines populations spermatogoniales. Au total, ces résultats concordent avec des observations antérieures suggérant que les RA sont présents dans les cellules somatiques du testicule; de ce fait, ce sont ces types cellulaires qui vraisemblablement répondent aux androgènes circulants pour contrôler la spermatogenèse. Cependant nos résultats montrent également un immunomarquage de certains élements de la lignée germinale ce qui réactualise la controverse concernant le fait de savoir si la lignée germinale peut répondre ou non directement aux androgènes.

Abstract

Whether or not germ cells contain the androgen receptor remains a matter of controversy. In the present study we performed biotinstreptavidin immunoperoxidase using an affinity purified rabbit polyclonal antibody made to a 21 amino acid peptide of the amino terminus of the rat AR to determine androgen receptor (AR) distribution in the rat and mouse testes. Specificity of the antibody was confirmed as follows: 1) Western immunoblots rendered a specific band at approximately 110 kD; 2) preadsorption of the antibody with the 21 amino acid peptide eliminated specifice immunostaining; 3) the intensity of staining in all AR positive cells diminished as a function of antisera dilution; 4) tissues known to express abundant AR (e.g., epididymis, prostate, seminal vesicles) all rendered a robust, nuclear AR immunostaining pattern in the epithelial cells; 5) prostate cell lines known to express AR immunostained positive with the antibody; 6) AR negative COS-7 cells became AR immunopositive when transfected with a vector expressing the rat AR and intracellular AR distribution was a function of androgens. AR immunostaining results revealed the following: Within the interstitial compartment of adult rats, AR was detected in some Leydig cells and all smooth muscle cells forming the walls of blood vessels, but endothelial cells were negative. In the seminiferous tubules AR was observed in all peritubular myoid cell nuelei, but not in the distal layer of Iymphatic endothelial cells. In Sertoli cells, nuclear AR immunostaining was stage specific; moderate AR immunostaining became evident at late stage IV of the cycle, reached a robust peak at stages VII-VIII, and then disappeared completely. Specific AR immunostaining was also discerned in the nuclei of stage XI elongated spermatids, in which nuclear elongation is apparent but chromatin condensation has not yet begun. With onset of chromatin condensation, nuclear AR immunostaining in elongated spermatids was not discerned concomitant with its detection in the cytoplasm. In general, similar observations have now been confirmed in the adult mouse testis, except that an Leydig cells were strongly AR positive. Nucleic acid in situ hybridization studies for AR were performed in adult rat testis using a 236 bp antisense cRNA probe (rat AR cDNA was provided by Dr. C. Chang, U. Wisconsin, Madison, WI) to confirm the AR immunostaining. A prominent hybridization signal at the base of the seminiferous epithelium was observed, in the area occupied by Sertofi and spermatogonia. This led us to re-examine the immunostaining results to determine if spermatogonia were also AR positive. Preliminary results are consistent with the interpretation that AR is present in certain spermatogonial populations. Taken together, these results concur with prior observations suggesting that AR is present in the somatic cells of the testis; thus, it is these cell types that likely respond to circulating androgens to control spermatogenesis. However, they raise anew the controversy of whether germ cells respond directly to androgens.