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Basic and Clinical Andrology

Open Access

Développement d'une méthode de quantification des ARN messagers par RT-PCR dans les biopsies testiculaires

  • H. Lejeune1,
  • R. Levy1, 3,
  • C. Brébant1,
  • J C. Crave1,
  • N. Berger-Dutrieux4,
  • M. Devonec5,
  • P. Durand6,
  • J M. Saez6 et
  • M. Pugeat1
AndrologieJournal officiel de la Société d’Andrologie de Langue Française6:BF03034451

https://doi.org/10.1007/BF03034451

The Erratum to this article has been published in Andrologie 1996 6:BF03035292

Résumé

Afin de mieux comprendre l'implication des facteurs de régulation de la spermatogenèse en pathologie humaine, nous avons développé une méthode de mesure des ARN messagers (ARNm) par reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), applicable à des fragments testiculaires de petite taille, tels que ceux obtenus lors des biopsies testiculaires. Nous présentons ici les aspects méthodologiques développés pour répondre aux contraintes liées:
  • • à la taille réduite des échantillons,

  • • au caractère non renouvelable de la biopsie testiculaire chirurgicale,

  • • au fait que la pathologie étudiée induit une modification de la composition cellulaire des échantillons (raréfaction des cellules de la lignée germinale).

Les développements méthodologiques ont été effectués à partir des testicules prélevés chez un sujet en état de mort cérébrale (histologie normale) et de 3 testicules pathologiques obtenus lors de castration pour cancer de la prostate et présentant des troubles de la spermatogenèse. Nous avons mesuré l'expression de gènes marqueurs de divers types cellulaires, clusterine pour les cellules de Sertoli, cytochrome P450 side chain cleavage (CyP450scc) pour les cellules de Leydig, protamine-1 pour les cellules germinales post-méiotiques; et d'un facteur para/autocrine testiculaire, la sous unité α de l'inhibine, par rapport à la ß-actine. Les méthodes développées permettent d'obtenir une mesure relative d'un ARNm d'intérêt par rapport à un ARNm de référence à partir de 0,1 μg d'ARN total (au lieu de 10–40 μg en Northern Blot).

La mesure des ARNm de l'α-inhibine dans des ARN testiculaires dilués par des ARN d'une lignée cellulaire n'exprimant pas l'α-inhibine (HepG2) montre une bonne corrélation avec les valeurs attendues (r=0,989; p=0,0015) et une bonne corrélation entre RT-PCR et Northern Blot (r=0,995; p=0,0005). En comparant l'expression des gènes étudiés dans les échantillons pathologiques par rapport au sujet contrôle, on observe une bonne corrélation entre RT-PCR et Northern blot (r=0,914; p=0,0002). Nos résultats concordent avec les constatations histologiques: absence d'expression de la protamine-1 dans les troubles sévères de la spermatogenèse, augmentation de l'expression du CyP450scc en cas d'hyperplasie leydigienne. L'expression de l'α-inhibine est en relation avec la proportion de cellules somatiques dans les échantillons. Ceci indique la nécessité d'une mesure relative de l'expression des facteurs paracrines, par rapport à des marqueurs spécifiques de chaque type cellulaire du testicule.

Ces méthodes vont permettre des études de l'expression des gènes des facteurs régulateurs de la spermatogenèse sur les biopsies testiculaires réalisées lors des soins de l'infertilité des patients.

Mots-clés

RT-PCRquantificationARN messagerstesticulespermatogenèsebiopsie

Notes

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